ACS Cent. Sci. | 基于氨基酸分辨率的新冠肺炎抗体图谱全景式检测多肽芯片

英文原题：SARS-CoV-2 proteome microarray for mapping COVID-19 antibody interactions at amino acid resolution

通讯作者：于晓波，蛋白质组学国家重点实验室，北京蛋白质组研究中心，国家蛋白质科学中心-北京，军事科学院军事医学研究院生命组学研究所；李永哲，中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院，检验科

作者：Hongye Wang (王红叶), Xian Wu (吴宪), Xiaomei Zhang (张晓梅), Xin Hou (侯欣), Te Liang (梁特), Dan Wang (王聃) , Fei Teng (腾飞), Jiayu Dai (代佳宇), Hu Duan (段虎), Shubin Guo (郭树彬)

新型肺炎疫情发现于2019年底，2020年1月30日，世界卫生组织将新冠肺炎疫情列为国际关注的突发公共卫生事件，同年3月宣布新冠疫情大流行，成为世界范围内的卫生紧急情况，并呼吁采取有效的应对措施。

新冠肺炎病毒SARS-CoV-2与SARS病毒具有82%同源性¹，一般而言，SARS-CoV-2具有一个多聚蛋白（Orf1ab，开放阅读框1a和1b），四个结构蛋白（envelope，E蛋白；membrane，M蛋白；nucleocapsid phosphoprotein，N蛋白；spike，S蛋白），五个辅助蛋白（Orf3a，Orf6，Orf7a, Orf8, Orf10）²。最大的多聚蛋白Orf1ab可以酶解为16个非结构蛋白，可能参与病毒RNA的复制和转录³。E蛋白、M蛋白在冠状病毒组装中发挥重要作用；N蛋白与病毒基因组形成复合体，对病毒转录和组装中具有重要作用；S蛋白在病毒颗粒表面，病毒通过S蛋白RBD结构域（receptor binding domain）与宿主ACE2（angiotensin-converting enzyme 2）受体相结合，进入细胞内部，进而侵染人体^4-5。

新冠肺炎病毒感染人体后，会分泌大量病毒抗体。鉴定这些抗体的抗原氨基靶点对临床诊断试剂开发和疫苗研发具有重要参考价值。迄今为止，对于这些抗体的氨基酸靶点尚未清楚。为此，于晓波研究员合作团队开发了SARS-CoV-2全蛋白质组多肽芯片，可以在氨基酸分辨率揭示患者体内针对病毒蛋白的特异性体液反应免疫图谱。

一、新冠肺炎病毒全蛋白组多肽芯片的制备和应用

图1. 新冠肺炎病毒全蛋白组多肽芯片的制备和应用

作者首先调取了新冠肺炎病毒基因组序列（No. MN908947.3），根据该系列序列设计了966条新冠病毒多肽探针，每条多肽含15个氨基酸，相邻多肽有5个氨基酸重叠，同时该芯片加入了临床诊断试剂所用的N、S蛋白。该芯片具有高度的灵敏度（94pg/ml）、重复性（r>0.99）、较宽的动力学范围，可以广泛应用于新冠病毒抗体检测，抗体试剂表位分析，标志物的鉴定以及免疫反应动态监测（图 1a）。

采用该芯片，作者首先对新冠病毒N蛋白两个抗体的特异性和交叉反应进行了评估。结果发现单克隆抗体具有较高的特异性，鉴定到两个抗原表位（RRGPE和PAADL）（图 1d）。多克隆抗体鉴定到较多的抗原表位，包括11个N蛋白表位及若干其他蛋白交叉反应抗原表位（图 1d）。

二、新冠肺炎病毒的IgG和IgM全景式图谱

采用该芯片，作者筛选了10例早期新冠肺炎患者血清，描绘出了患者血清中新冠肺炎病毒蛋白抗体的全景式图谱。结果共鉴定到61个抗原表位，其中Orf1ab抗原表位数目最多（共32个），分布在nsp1-4，nsp6，nsp8-10，nsp12-16（图 2，图 3）。对于其他蛋白抗原表位数目分别为：S蛋白8个，N蛋白8个，M蛋白5个，Orf3a蛋白4个，Orf7a蛋白3个，Orf8蛋白1个。值得注意的是，在80%新冠肺炎病毒患者中鉴定到4个免疫优势表位，包括N蛋白 (residue 206−210, SPARM)，S蛋白(residue 816−820, SFIED)，Orf3a蛋白(residue 136−140, KNPLL; residue 176−180, SPISE)。S蛋白共鉴定到3个IgM抗原表位和6个IgG抗原表位（图 4）。N蛋白共鉴定到2个IgM抗原表位和8个IgG抗原表位（图 4）。

图2. 新冠肺炎病毒Orf1ab蛋白的IgM抗体免疫反应图谱

图3. 新冠肺炎病毒Orf1ab蛋白的IgG抗体免疫反应图谱

图4. 新冠肺炎病毒结构蛋白和辅助蛋白的抗体免疫反应图谱

三、抗原氨基酸表位的结构分析

图5. N 和 S 蛋白抗原表位的结构分析

进一步结构分析N蛋白抗原表位分布在蛋白外侧loop区域，S蛋白表位分布在表面和内部。

四、新冠肺炎病毒检测标志物和中和抗体表位的鉴定

图6. 新冠肺炎病毒检测标志物和中和抗体表位的鉴定

首先，作者比较了10例对照（疑似病例，核酸检测阴性）与10例早期患者抗体水平，鉴定了6个候选抗体标志物分子，其抗体水平患者组明显高于对照组（图 6a）。 

其次，采用该平台，作者共鉴定7个具有免疫原性多肽位于S蛋白RBD结构域。其中抗原多肽（residues 456−460, FRKSN），在5个患者中鉴定到了该抗原多肽的IgG抗体，在2个患者中鉴定到了该抗原多肽的IgM抗体（图 6b，c）。对RBD-ACE2复合体结构分析表明，此抗原表位位于RBD-ACE2结合界面（图 6d）。值得关注的是，在最近发表在SCIENCE（DOI: 10.1126/science.abc2241）的文章中报道，研究人员在COVID-19康复期患者血清中分离得到该抗原表位（residues 456−460, FRKSN）的中和抗体⁶。

综上所述，作者设计和开发SARS-CoV-2病毒全蛋白组多肽芯片，可以大规模用于新冠病毒的检测。 

该芯片平台具有以下用途： 

1）新冠肺炎患者体液抗体免疫反应图谱。全面评估新冠肺炎患者针对病毒蛋白产生的免疫反应，监测新冠病毒引发的患者免疫响应进程，帮助我们了解人体对于病毒感染的免疫状态的变化。

 2）新冠病毒检测抗原抗体检测试剂原料的特异性表征。该平台可实现抗体表位的大规模鉴定，建立抗体免疫表位数据库，解析新冠病毒抗体试剂对于靶标抗原的特异性和交叉反应，进而指导临床检测试剂的开发。

3）新冠病毒中和性抗体的筛选和鉴定。作为免疫系统体液免疫反应中的一部分，中和抗体在病毒清除和患者治疗中有着关键作用。本文鉴定到的抗原表位（residue 456−460, FRKSN）作为一种抗原，可能刺激中和抗体的产生并增强CD4+/CD8+ T细胞反应。 

4）新冠疫苗接种的免疫反应评估。该平台可实现疫苗注射前后，动态检测受试者血清中针对病毒蛋白质组抗体水平，将其数据与接种人群感染率进行综合分析，助力疫苗研发及推广使用。

本研究的相关结果已发表于 ACS Central Science 到目前为止已经得到 Nature、Nature Microbiology、Nature Communications 和 Genome Medicine 等权威期刊引用60余次。国家蛋白质科学中心-北京，王红叶，张晓梅，中国医学科学院北京协和医学院吴宪，侯欣为文章共同第一作者。国家蛋白质科学中心-北京于晓波研究员，中国医学科学院北京协和医学院李永哲教授为该文章的共同通讯作者。 

本项目得到了国家精准医学和新药创制重大专项、蛋白质组学国家重点实验室自主研究项目、北京市教委专项、国家自然科学基金、中国医学科学院医学与健康科技创新工程的支持。

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ACS Cent. Sci. 2020, 6, 12, 2238–2249

Publication Date: October 21, 2020

https://doi.org/10.1021/acscentsci.0c00742

Copyright © 2021 American Chemical Society

参考文献：

1.  Chan, J. F.; Kok, K. H.; Zhu, Z.; Chu, H.; To, K. K.; Yuan, S.; Yuen, K. Y., Genomic characterization of the 2019 novel human-pathogenic coronavirus isolated from a patient with atypical pneumonia after visiting Wuhan. Emerg Microbes Infect 2020, 9 (1), 221-236.

2.  Narayanan, K.; Huang, C.; Makino, S., SARS coronavirus accessory proteins. Virus Res 2008, 133 (1), 113-21.

3. Dinesh., D.; Chalupska., D.; Silhan., J.; Veverka., V.; Boura., E., Structural basis of RNA recognition by the SARS-CoV-2 nucleocapsid phosphoprotein. medRxiv  2020. DOI:10.1101/2020.04.02.022194.

4.  Walls, A. C.; Park, Y. J.; Tortorici, M. A.; Wall, A.; McGuire, A. T.; Veesler, D., Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein. Cell  2020.

5. Wang, Q.; Zhang, Y.; Wu, L.; Niu, S.; Song, C.; Zhang, Z.; Lu, G.; Qiao, C.; Hu, Y.; Yuen, K. Y.; Wang, Q.; Zhou, H.; Yan, J.; Qi, J., Structural and Functional Basis of SARS-CoV-2 Entry by Using Human ACE2. Cell  2020.

6.  Wu, Y.; Wang, F.; Shen, C.; Peng, W.; Li, D.; Zhao, C.; Li, Z.; Li, S.; Bi, Y.; Yang, Y.; Gong, Y.; Xiao, H.; Fan, Z.; Tan, S.; Wu, G.; Tan, W.; Lu, X.; Fan, C.; Wang, Q.; Liu, Y.; Zhang, C.; Qi, J.; Gao, G. F.; Gao, F.; Liu, L., A noncompeting pair of human neutralizing antibodies block COVID-19 virus binding to its receptor ACE2. Science  2020.

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